Содержание
Окрашивание по Граму - это дифференциальная процедура окрашивания, которая показывает, какие бактерии являются грамположительными или грамотрицательными в зависимости от цвета окраски. Ацетоновый спирт является одним из реагентов, используемых в этом процессе для обеспечения цветовой дифференциации. Грамположительные бактерии имеют толстый слой пептидогликана и окрашиваются в пурпурный цвет, тогда как грамотрицательные микроорганизмы практически не имеют слоя пептидогликана и окрашиваются в розовый цвет.
Первичный Пятно-Кристалл Фиолетовый
Как только слайд бактериального образца приготовлен, сначала используется кристаллический фиолетовый, чтобы окрасить образец. В этот момент и грамположительные, и грамотрицательные бактерии будут выглядеть фиолетовыми. Обычно кристаллический фиолетовый наносят на предметное стекло на 30 секунд, прежде чем смыть любое лишнее пятно водой. Кристаллический фиолетовый может немного прилипать к слоям пептидогликана, поэтому не все первичное пятно смывается водой.
Морилка-Йод
Йод затем добавляется к образцу в течение одной минуты. Он действует как протрава, которая служит для фиксации красителей в процессе окрашивания. Йод выполняет эту функцию, связываясь с кристаллическим фиолетовым и создавая нерастворимый комплекс, который гораздо лучше сцепляется с толстым слоем пептидогликана, содержащегося в грамположительных бактериальных клетках, чем только один кристаллический фиолетовый. После добавления йода не происходит промывки водой.
Decolorizer-Alcohol
В качестве обесцвечивающего агента можно использовать либо ацетон, либо этиловый спирт. Спирт растворяет липиды, обнаруженные во внешней клеточной мембране грамотрицательных бактерий, что позволяет кристаллическому комплексу йода с фиолетовой кислотой вытекать из более тонкого слоя пептидогликана. Спирт добавляют в течение 10-20 секунд; его выливают на предметное стекло до тех пор, пока весь йод не вымывается и сток не становится бесцветным. На этом этапе процесса окрашивания по Граму грамотрицательные бактерии бесцветны, а грамположительные бактерии все еще сохраняют кристаллический фиолетовый. По окончании слайд необходимо промыть водой, чтобы остановить обесцвечивающий эффект.
Контрастное-Safranin
Затем добавляют сафранин, чтобы увеличить видимость и контраст по сравнению с бесцветными грамотрицательными бактериями. Пятно делает эти бактерии розовыми под микроскопом. Поскольку пятно добавляется ко всему образцу, оно также окрашивает грамположительные бактерии, но более темный кристаллический фиолетовый скрывает более светлый сафранин-розовый цвет. После того, как образец для скольжения был залит сафранином в течение приблизительно минуты, вода используется для смыва любого лишнего пятна, которое не прилипало к бактериальным клеткам.