Содержание
В химических реакциях, катализируемых ферментом, фермент снижает количество энергии активации, необходимое, временно связываясь с субстратом и переворачивая его в напряженное состояние. K (катализатор) или «kcat» для реакции относится к не зависящей от концентрации константе для скорости, с которой конкретный фермент может метаболизировать субстрат в молекулу продукта. Чтобы рассчитать kcat, ученые сначала смешивают несколько пробирок с различными концентрациями субстрата (известный как «ферментативный анализ») и тестируют их через постоянные промежутки времени с помощью светового спектрофотометра для измерения растущих концентраций молекул продукта. Эти данные затем наносятся на график и анализируются.
Расчет начальных скоростей
Постройте график зависимости концентрации продукта от времени для данных из первой пробирки для ферментативных анализов. Примечание: горизонтальная ось должна быть «время», а вертикальная ось должна быть «концентрация продукта».
Вычислите линию линейной регрессии для точек данных, которые вы построили в Разделе 1, Шаг 1. Хотя Excel и графические калькуляторы могут легко определить эту линейную модель, вы можете получить оценку наклона линий регрессии, разделив разницу в концентрации продукта между соседними данными. указывает на их разницу во времени.
Запишите наклон линии линейной регрессии из Раздела 1, Шаг 2 как «начальная скорость реакции (Vo)». Примечание: в модели линии регрессии "= m + b" коэффициент "m" является наклоном.
Повторите шаги 1, 2 и 3 для остальных пробирок в анализе.
Расчет Vmax
Постройте обратную зависимость концентрации субстрата для каждой пробирки от обратной ее начальной скорости реакции (из Раздела 1, Шаг 4). Например, если начальная скорость для пробирки с начальной концентрацией субстрата 50 микромоль (мкМ) составляла 80 мкМ / с, обратная скорость составляла бы 1/50 мкМ для концентрации субстрата и 1/80 мкМ / с для начальной скорость. Примечание: обратная концентрация субстрата должна быть на горизонтальной оси, а обратная начальная скорость должна быть на вертикальной оси.
Примечание: концентрация субстрата должна быть на горизонтальной оси, а начальная скорость реакции должна быть на вертикальной оси.
Определите линию линейной регрессии для диаграммы, которую вы построили в Разделе 2, Шаг 1. Примечание: поскольку вам необходимо знать y-пересечение для линии регрессии, вы должны ввести точки из Раздела 2, Шаг 1 либо в Excel, либо в Графический калькулятор и использовать встроенные функции регрессионного моделирования.
Разделите 1 на y-пересечение от линии линейной регрессии. Это даст вам значение обратной Vmax, максимальной скорости реакции для фермента. Примечание: если модель линейной регрессии принимает форму "= m + b", то значением "b" будет y-пересечение. Разделите 1 на «b», чтобы вычислить обратное значение Vmax.
Разделите 1 на результат из Раздела 2, Шаг 3, чтобы вычислить фактическое значение Vmax.
Определите концентрацию фермента в исходном анализе (см. Необработанные данные). Примечание: концентрация фермента одинакова для всех пробирок; в анализе изменяются только концентрации субстрата.
Разделите Vmax (из Раздела 2, Шаг 4) на концентрацию фермента (из Раздела 2, Шаг 5). Результатом является значение Kcat.