Содержание
- Геномика и секвенирование ДНК
- Определение секвенирования ДНК
- Секвенирование ДНК: раннее исследование
- Самой большой целью Сэнгера было секвенирование крупномасштабных целых геномов, но секвенирование пар оснований минимального бактериофага побледнело по сравнению с секвенированием 3 миллиардов пар оснований человеческого генома. Тем не менее, изучение того, как секвенировать весь геном слабого бактериофага, было важным шагом к объединению всего генома человека. Поскольку ДНК и хромосомы состоят из миллионов пар оснований, большинство методов секвенирования разделяют ДНК на маленькие нити, и затем сегменты ДНК соединяются вместе; это требует времени или быстрых, сложных машин.
- Основы секвенирования ДНК
- Методы секвенирования ДНК: методы Сангера
- Другим интересным событием стал метод дробовика, который случайным образом отбирал и упорядочивал до 700 пар оснований одновременно. Сэнгер также известен тем, что он использовал метод дидезокси (дидезоксинуклеотид), который вставляет нуклеотид с концевой цепью во время синтеза ДНК, чтобы пометить участки ДНК для анализа. Дидезоксинуклеотиды нарушают активность ДНК-полимеразы и предотвращают накопление нуклеотидов на цепочке ДНК.
- Этапы секвенирования ДНК
- Достижения в технологии секвенирования ДНК
- Проект генома человека
- Другие примеры секвенирования ДНК
- Этические последствия секвенирования ДНК
Нуклеотиды являются химическими строительными блоками жизни и находятся в ДНК живых организмов. Каждый нуклеотид состоит из сахар, фосфат и азотсодержащее основание: аденин (А), тимин (Т), цитозин (С) и гуанин (G). Конкретный порядок этих нуклеотидных оснований определяет, какие белки, ферменты и молекулы будут синтезироваться клеткой.
Определение порядка или последовательности нуклеотидов важно для изучения мутаций, эволюции, прогрессирования заболевания, генетического тестирования, судебно-медицинской экспертизы и медицины.
Геномика и секвенирование ДНК
Genomics является изучение ДНК, генов, взаимодействия генов и влияния окружающей среды на гены. Секрет раскрытия сложной внутренней работы генов заключается в том, чтобы определить их структуру и расположение на хромосомах.
Синий цвет живых организмов определяется порядком (или последовательностью) пар оснований нуклеиновых кислот в ДНК. Когда ДНК реплицируется, аденин соединяется с тимином, а цитозин с гуанином; несовпадающие пары считаются мутации.
С тех пор как в 1953 году была разработана концепция молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с двойной спиралью, в области геномики и крупномасштабного секвенирования ДНК были сделаны значительные улучшения. Ученые усердно работают над тем, чтобы применить эти новые знания для индивидуального лечения заболеваний.
В то же время продолжающиеся дискуссии позволяют исследователям опережать этические последствия таких стремительно развивающихся технологий.
Определение секвенирования ДНК
Секвенирование ДНК - это процесс обнаружения последовательности различных нуклеотидных оснований во фрагментах ДНК. Секвенирование всего гена позволяет сравнивать хромосомы и геномы, присутствующие у одного и того же и разных видов.
Картирование хромосом полезно для научных исследований. Анализ механизмов и структуры генов, аллелей и хромосомных мутаций в молекулах ДНК предлагает, например, новые способы лечения генетических нарушений и остановки роста раковых опухолей.
Секвенирование ДНК: раннее исследование
Методы секвенирования ДНК Фредерика Сангера значительно продвинулся в области геномики, начиная с 1970-х годов. Sanger чувствовал себя готовым заняться секвенированием ДНК после успешного секвенирования РНК при изучении инсулина. Сэнгер был не первым ученым, который занимался секвенированием ДНК. Тем не менее, его умные методы секвенирования ДНК, разработанные совместно с коллегами Бергом и Гилбертом, получили Нобелевскую премию в 1980 году.
Самой большой целью Сэнгера было секвенирование крупномасштабных целых геномов, но секвенирование пар оснований минимального бактериофага побледнело по сравнению с секвенированием 3 миллиардов пар оснований человеческого генома. Тем не менее, изучение того, как секвенировать весь геном слабого бактериофага, было важным шагом к объединению всего генома человека. Поскольку ДНК и хромосомы состоят из миллионов пар оснований, большинство методов секвенирования разделяют ДНК на маленькие нити, и затем сегменты ДНК соединяются вместе; это требует времени или быстрых, сложных машин.
Основы секвенирования ДНК
Сэнгер знал потенциальную ценность своей работы и часто сотрудничал с другими учеными, которые разделяли его интересы в области ДНК, молекулярной биологии и наук о жизни.
Хотя методы секвенирования ДНК Сэнгера были медленными и дорогими по сравнению с современными технологиями секвенирования, в то время их хвалили. После проб и ошибок Сэнгер нашел секретный биохимический «рецепт» для разделения нитей ДНК, создания большего количества ДНК и определения порядка нуклеотидов в геноме.
Высококачественные материалы можно легко приобрести для использования в лабораторных исследованиях:
Методы секвенирования ДНК: методы Сангера
Сэнгер выяснил, как разрезать ДНК на маленькие сегменты с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Затем он сделал больше ДНК из матрицы и вставил радиоактивные метки в новую ДНК, чтобы разграничить участки разделенных нитей. Он также признал, что ферменту нужен праймер, который может связываться с определенным местом на цепи матрицы. В 1981 году Сэнгер снова вошел в историю, выяснив геном митохондриальной ДНК из 16 000 пар оснований.
Другим интересным событием стал метод дробовика, который случайным образом отбирал и упорядочивал до 700 пар оснований одновременно. Сэнгер также известен тем, что он использовал метод дидезокси (дидезоксинуклеотид), который вставляет нуклеотид с концевой цепью во время синтеза ДНК, чтобы пометить участки ДНК для анализа. Дидезоксинуклеотиды нарушают активность ДНК-полимеразы и предотвращают накопление нуклеотидов на цепочке ДНК.
Этапы секвенирования ДНК
Температура должна быть тщательно отрегулирована на протяжении всего процесса секвенирования. Сначала химические вещества добавляют в пробирку и нагревают, чтобы распутать (денатурировать) двухцепочечную молекулу ДНК. Затем температура охлаждается, позволяя грунтовке склеиться.
Затем температуру повышают, чтобы стимулировать оптимальную активность ДНК-полимеразы (фермента).
Полимераза обычно использует обычные доступные нуклеотиды, которые добавляются в более высокой концентрации.Когда полимераза попадает к «оканчивающему цепь» нуклеотиду, связанному с красителем, полимераза останавливается, и цепь там заканчивается, что объясняет, почему окрашенные нуклеотиды называются «оканчивающимися цепью» или «терминаторами».
Процесс продолжается много, много раз. В конце концов, связанный с красителем нуклеотид был помещен в каждую позицию ДНК. Гель-электрофорез и компьютерные программы могут затем определить цвета красителя на каждой из цепей ДНК и выяснить всю последовательность ДНК на основе красителя, положения красителя и длины нитей.
Достижения в технологии секвенирования ДНК
Высокопроизводительное секвенирование - обычно упоминается как секвенирование следующего поколения - использует новые достижения и технологии для последовательности нуклеотидных оснований быстрее и дешевле, чем когда-либо прежде. Машина секвенирования ДНК может легко обрабатывать крупномасштабные участки ДНК. Фактически, весь геном может быть сделан в течение нескольких часов, а не лет с помощью методов секвенирования Сэнгера.
Методы секвенирования следующего поколения могут проводить анализ ДНК в больших объемах без дополнительного этапа амплификации или клонирования, чтобы получить достаточно ДНК для секвенирования. Машины для секвенирования ДНК проводят несколько реакций секвенирования одновременно, что дешевле и быстрее.
По сути, новая технология секвенирования ДНК запускает сотни реакций Сэнгера на небольшом, легко читаемом микрочипе, который затем запускается через компьютерную программу, которая собирает последовательность.
Метод считывает более короткие фрагменты ДНК, но он все же быстрее и эффективнее, чем методы секвенирования Сэнгера, поэтому даже крупные проекты могут быть быстро завершены.
Проект генома человека
Проект генома человекаЗавершено в 2003 году, является одним из самых известных исследований секвенирования, выполненных на сегодняшний день. Согласно статье 2018 года в Новости наукигеном человека состоит примерно из 46 831 ген, который был огромным вызовом последовательности. Лучшие ученые со всего мира потратили почти 10 лет на сотрудничество и консалтинг. Под руководством Национального исследования генома человека
Институт, проект успешно наметил геном человека с использованием составного образца, взятого у анонимных доноров крови.
Проект «Геном человека» основывался на методах секвенирования бактериальной искусственной хромосомы (на основе BAC) для определения пар оснований. Техника использовала бактерии для клонирования фрагментов ДНК, что приводило к образованию большого количества ДНК для секвенирования. Затем клоны уменьшали в размерах, помещали в секвенатор и собирали в отрезки, представляющие ДНК человека.
Другие примеры секвенирования ДНК
Новые открытия в области геномики представляют собой глубоко меняющиеся подходы к профилактике, выявлению и лечению заболеваний. Правительство выделило миллиарды долларов на исследования ДНК. Правоохранительные органы полагаются на анализ ДНК для решения дел. Наборы для тестирования ДНК можно приобрести для домашнего использования, чтобы исследовать происхождение и определить варианты генов, которые могут представлять риск для здоровья:
Этические последствия секвенирования ДНК
Новые технологии часто приходят с возможностью социальной выгоды, а также вреда; примеры включают в себя неисправные атомные электростанции и ядерное оружие массового уничтожения. Технологии ДНК тоже сопряжены с риском.
Эмоциональное беспокойство по поводу инструментов секвенирования ДНК и инструментов редактирования генов, таких как CRISPR, включает опасения, что технология может облегчить клонирование человека или привести к появлению мутантных трансгенных животных, созданных ученым-изгоем.
Чаще этические проблемы, связанные с секвенированием ДНК, связаны с информированным согласием. Простой доступ к тестированию ДНК непосредственно для потребителя означает, что потребители могут не полностью понимать, как их генетическая информация будет использоваться, храниться и делиться. Миряне могут быть эмоционально не готовы узнать о своих дефектных вариантах генов и рисках для здоровья.
Третьи стороны, такие как работодатели и страховые компании, могут потенциально дискриминировать лиц, которые имеют дефектные гены, что может привести к серьезным медицинским проблемам.