Содержание
При работе с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) хорошая калибровка абсолютно необходима для обеспечения надежных и качественных результатов. Правильная калибровка прибора ВЭЖХ начинается с создания подходящего калибровочного стандарта. В большинстве случаев калибровка на самом деле требует ряда стандартов увеличения концентрации для получения так называемой калибровочной кривой. Это график и соответствующее уравнение, которое описывает взаимосвязь между концентрацией исследуемого химического вещества и реакцией детектора ВЭЖХ.
Определите химическое вещество, которое вы хотите проверить для использования ВЭЖХ («аналит»). Например, вы можете попробовать серию безалкогольных напитков на содержание фруктозы, и в этом случае фруктоза будет аналитом.
Получите некоторое количество химического вещества аналита подходящей чистоты. Обычно чистота должна быть выше 99%, и аналит должен быть приобретен у уважаемой компании-поставщика химикатов. Например, в случае с фруктозой вы бы купили чистую фруктозу у продавца химикатов, а не в продуктовом магазине.
Определите максимальные и минимальные ожидаемые концентрации аналита в пробах, которые вы собираетесь тестировать с помощью ВЭЖХ. В случае безалкогольных напитков вы должны изучить этикетки напитков и определить минимальное и максимальное содержание фруктозы среди напитков, которые вы будете тестировать. Имейте в виду, что исходный образец (безалкогольный напиток) может быть разбавлен или иным образом изменен во время подготовки к анализу (в зависимости от используемого метода ВЭЖХ), и поэтому концентрация аналита в образцах, фактически введенных в ВЭЖХ, может быть изменена. Необходимо учитывать концентрацию аналита в образцах при проведении ВЭЖХ.
Определите растворитель, в котором вы растворите свой аналит, чтобы составить калибровочные стандарты. Этот растворитель должен быть способен правильно растворять аналит в относительно широком диапазоне концентраций (по крайней мере, так же высоко, как в образцах, которые вы собираетесь тестировать). Кроме того, этот растворитель в идеале должен быть очень похож на «подвижную фазу»: растворитель, используемый для переноса образцов через прибор ВЭЖХ.
Рассчитайте количество аналита, необходимое для приготовления стандартного раствора аналита. Это определяется путем умножения требуемой концентрации исходного запаса на желаемый объем. Концентрация аналита в этом растворе должна быть как минимум на 10% выше, чем самая высокая ожидаемая концентрация образца. Если наивысшая ожидаемая концентрация фруктозы в образце безалкогольного напитка составляет 8 грамм / 100 миллилитров, то стандартный исходный материал может быть достигнут до концентрации 10 грамм фруктозы / 100 миллилитров. Разумный объем составляет 500 мл, поэтому потребуется 8/100 мл х 500 мл = 40 г фруктозы.
Взвесьте необходимое количество аналита с подходящим уровнем точности. Часто подходит значение веса в граммах с точностью до одного или двух десятичных знаков, но для некоторых методов может потребоваться большая точность.
Перенесите взвешенный аналит в мерную колбу необходимого объема и добавьте желаемый растворитель к отметке заполнения на колбе. Использование мерной колбы (например, не мерного стакана) повышает точность стандартного значения концентрации. Убедитесь, что весь аналит переносится в колбу; используйте часть растворителя, чтобы вымыть его, если это необходимо.
Закройте мерную колбу и осторожно встряхните или переверните, пока аналит полностью не растворится.
Сделайте серию различных разведений исходного стандарта, перенеся известные объемы исходного стандарта в мерные колбы, используя пипетки для точного переноса, затем добавив растворитель. Самая низкая стандартная концентрация должна быть ниже самой низкой ожидаемой пробы для анализа. В примере безалкогольного напитка, если наименьшая ожидаемая концентрация фруктозы в образце составляет 2 г / 100 мл, тогда можно получить стандарт 1 г / 100 мл. Это будет сделано путем десятикратного разбавления стандартного запаса. Стандартные серии должны включать в общей сложности 5 или 6 концентраций, поэтому потребуются дополнительные разведения для получения стандартов, возможно, 3, 5 и 8 г фруктозы / мл. Теперь у вас есть ряд стандартных решений для калибровки ВЭЖХ.