Содержание
- Преимущество: чувствительность
- Преимущество: Специфика
- Недостаток: склонность к ложным или субъективным результатам
- Недостаток: высокая стоимость и технический спрос
Вестерн-блот, аналитическая методика, используемая для точного определения конкретного белка в данном образце, использует способность фермента или меченного флуоресценцией первичного антитела связываться со своим специфическим антигеном. Это трехэтапный процесс, начинающийся с гель-электрофореза, с последующим мембранным блоттингом и зондированием антителами. Обнаружение белка может быть прямым или косвенным, при этом последний использует меченое вторичное антитело, направленное против первичного. Несмотря на то, что вестерн-блоттинг принят в качестве рутинного метода анализа белка, он имеет свои ограничения и преимущества
Преимущество: чувствительность
Одним из главных аргументов в пользу вестерн-блоттинга является его чувствительность. Благодаря своей способности обнаруживать всего 0,1 нанограмма белка в образце, метод теоретически может служить эффективным инструментом ранней диагностики, обнаруживая даже малейший иммуногенный ответ от вируса или бактерии в образце пациента. Непрямое вестерн-блоттинг дополнительно основывается на этой чувствительности благодаря способности вторичного антитела усиливать интенсивность сигнала, обнаруженного системой визуализации. Большая чувствительность означает, что для тестирования требуется меньше антител, что значительно сокращает лабораторные расходы.
Преимущество: Специфика
Техника вестерн-блоттинга обязана своей спецификой двум важным факторам. Во-первых, гель-электрофорез сортирует образец на белки разного размера, заряда и конформации. Этот процесс сам по себе является огромным шагом к обнаружению, поскольку сформированные в геле полосы уже дают представление о размере интересующего белка или полипептида. Специфичность взаимодействия антитело-антиген служит вторым важным фактором. Поскольку специфические антитела проявляют сродство к конкретным белкам, процесс может избирательно обнаруживать целевой белок даже в смеси 300 000 различных белков.
Недостаток: склонность к ложным или субъективным результатам
Несмотря на свою чувствительность и специфичность, вестерн-блот может все же давать ошибочные результаты. Ложноположительный результат возникает, когда антитело реагирует с не предназначенным для этого белком, что часто происходит, когда у пациента, проходящего тестирование на ВИЧ, случается туберкулез или ряд паразитарных инфекций. С другой стороны, ложноотрицательный результат может легко возникнуть, если более крупным белкам не дать достаточно времени для правильной передачи на мембрану. Неправильное блоттинг и обработка часто приводят к перекосу, выцветанию или даже к нескольким полосам, что делает результаты испытаний доступными для интерпретации специалистом.
Недостаток: высокая стоимость и технический спрос
Стоимость вестерн-блоттинга представляет собой совокупность больших индивидуальных расходов на меченые антитела, квалифицированных аналитиков и лабораторного оборудования. Деликатный процесс, вестерн-блоттинг требует точности на каждом этапе для правильной идентификации компонентов образца. Незначительная ошибка в концентрации реагента или в инкубационном периоде может иметь катастрофические последствия для всего процесса. Наконец, оборудование, необходимое для обнаружения и визуализации - хемилюминесцентные, флуоресцентные, радиоактивные или лазерные системы обнаружения - может быть слишком дорогим для среднего подразделения микробиологии.