Содержание
Количественный анализ образца РНК путем измерения его поглощения ультрафиолетового света (УФ). Нанокапельный спектрофотометр будет использовать только один или два микролитра вашего образца, которые вы можете восстановить. Другие спектрофотометры требуют гораздо большего образца. Коэффициент экстинкции для нуклеотидов на длине волны УФ-излучения 260 нм на пути света 1 см составляет 20. На основании этого коэффициента экстинкции поглощение 40 мкг / мл РНК при тех же условиях равно единице. Используя эту информацию, вы можете рассчитать концентрацию образца РНК.
При необходимости разбавьте образец. Стандартное разведение для микрокюветы составляет 1:40. Сделайте это разбавление, добавив 2 мкл образца РНК к 78 мкл стерильной воды.
Следуйте протоколам вашего конкретного спектрофотометра, чтобы откалибровать устройство с помощью бланка, а затем определить оптическую плотность вашего образца при длине волны УФ-излучения 260 нм.
Умножьте оптическую плотность вашего образца на коэффициент разбавления на 40 мкг РНК / мл. Уравнение будет следующим: «Концентрация РНК (мкг / мл) = (OD260) x (коэффициент разведения) x (40 мкг РНК / мл) / (1 единица OD260)» (Hofstra.edu) Например: если вы разбавили свой образец с помощью 1:40, и ваше значение поглощения было 0,08, вы умножили бы 0,08 х 40 х 40 = 128 мкг / мл = 0,13 мкг / мкл
Определите чистоту вашего образца, взяв еще одно значение поглощения при длине волны 280 нм. Отношение OD 260 / OD 280 покажет, загрязнен ли ваш образец белком или фенолом и на каком уровне. Результат от 1,8 до 2,0 указывает на качество РНК.