Содержание
- Электрофорез имеет ограниченный анализ проб
- Измерения электрофореза не точны
- Необходим существенный стартовый образец
- Только некоторые молекулы могут быть визуализированы
- Электрофорез с низкой пропускной способностью
Гель-электрофорез - это метод, при котором биологические молекулы отделяются друг от друга и идентифицируются в биологических исследованиях или медицинской диагностике. С тех пор, как они были разработаны в 1970-х годах, эти методы были неоценимы при определении генов (ДНК) и генных продуктов (РНК и белка), представляющих научный интерес. В последние годы появились новые методы, которые дают большую специфичность и детализацию того, что происходит в живых системах. Хотя они не вытеснили методы электрофореза, и продвинутые манипуляции могут расширить жизнеспособность метода, важно понять, что гель-электрофорез может и не может делать.
Электрофорез имеет ограниченный анализ проб
Электрофорез специфичен для любой ткани, которую вы взяли. Например, если вы выполняете саузерн-блот (тип электрофореза) на щечном тампоне, вы смотрите на гены из эпителиальных клеток вашей щеки и больше нигде в вашем теле. Иногда это может быть полезным, но исследователи часто заинтересованы в более распространенных эффектах.
Такие методы, как гибридизация in situ (ISH), могут взять срез ткани и проанализировать экспрессию генов в каждой небольшой области этого образца.Таким образом, исследователи могут смотреть на каждую область мозга в образце с ISH, тогда как методы электрофореза могут рассматривать только несколько областей одновременно.
Измерения электрофореза не точны
Гель-электрофорез может эффективно разделять похожие белки с разной массой (это метод, называемый вестерн-блоттингом). Это может разделить их более точно с помощью метода, известного как 2d электрофорез; это часто встречается в протеомике.
К сожалению, все измерения, сделанные с помощью этого метода, в лучшем случае являются полуколичественными. Чтобы получить точную массу (вес) белков, масс-спектроскопия должна применяться после того, как белок был очищен с помощью электрофореза. Кроме того, сравнение относительных количеств разных молекул основывается на плотности полос (темноте) разных пятен на геле. Этот метод имеет некоторую степень ошибки, и образцы обычно запускаются несколько раз, чтобы получить чистые результаты.
Необходим существенный стартовый образец
Электрофорез - это метод выделения и визуальной идентификации различных биомолекул. Это делается путем пропускания электрического тока через гель для разделения заряженных молекул разного веса. Если молекула, в которой вы заинтересованы, недостаточно распространена, ее полоса будет практически невидимой и ее трудно измерить.
ДНК и РНК можно несколько амплифицировать перед проведением электрофореза, но это не практично делать с белками. Поэтому для проведения этих анализов необходим большой образец ткани. Это может ограничить полезность метода, особенно в медицинском анализе. Практически невозможно провести электрофорез на образцах из одной ячейки; Проточная цитометрия и иммуногистохимия чаще используются для оценки межклеточной экспрессии белков. Методика, называемая ПЦР, отлично подходит для точного измерения крошечных количеств РНК.
Только некоторые молекулы могут быть визуализированы
Электрофорез отлично подходит для разделения и идентификации биомолекул среднего и большого размера. Тем не менее, многие молекулы, на которые исследователи хотят взглянуть, меньше; мелкие гормоны, нейротрансмиттеры и ионы не могут быть измерены с помощью электрофореза. Это происходит по двум причинам: они не реагируют должным образом с препаратом для электрофореза (обычно это метод, называемый SDS PAGE), и, даже если они это сделали, они слишком малы, чтобы их можно было правильно отделить, и они выскочили бы из нижней части геля. Эти молекулы вместо этого измеряются такими методами, как RIAA (радиоиммунологические анализы) и ELISA (энзим-связанный иммуноферментный анализ).
Электрофорез с низкой пропускной способностью
Гель-электрофорез, как правило, имеет низкую пропускную способность, что означает, что он не дает данных особенно быстро. Контрастный электрофорез, где вы можете посмотреть на небольшое количество молекул РНК одновременно, с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция), которая может одновременно оценивать тысячи образцов. Точно так же проточная цитометрия может проводить измерения от тысяч отдельных клеток и делать сложные корреляции, в то время как электрофорез смотрит на клетки в целом и не может сделать такие тонкие различия. ПЦР и проточная цитометрия представляют собой массово параллельные и последовательные процессы соответственно, и оба значительно превосходят возможности электрофореза для получения данных исследований.