Содержание
Вестерн-блоттинг - одна из самых распространенных процедур в биохимических лабораториях. По сути, он отделяет белки от образца по размеру, а затем тестирует с использованием антител, чтобы определить, присутствует ли данный белок. Это полезно не только в научных, но и в медицинских или диагностических лабораториях; тесты как на ВИЧ, так и на болезнь Лайма, например, включают в себя тест на иммуноферментный анализ (ИФА), а затем вестерн-блот, если результаты ИФА положительные. Несмотря на свою популярность, западное блоттинг имеет ряд недостатков.
неколичественных
Классические вестерн-блоты не количественные. Другими словами, хотя они могут сообщать исследователям, присутствует ли конкретный белок, они не позволяют количественно определить, сколько белка присутствует. Некоторые биотехнологические компании в настоящее время продают наборы, которые позволяют исследователям или лаборантам количественно определять количество присутствующего белка с использованием стандартной кривой - но это работает только при наличии чистых образцов того же белка. Более того, молекулярную массу белка можно оценить только с помощью вестерн-блоттинга, а не точно определить, как с помощью масс-спектрометрии.
Антитела
Вестерн-блоттинг можно проводить только при наличии первичных антител против белка, представляющего интерес. Хотя антитела для многих различных белков доступны от биотехнологических компаний, они недешевы; Если первичные антитела не доступны для данного белка, будет невозможно выполнить Вестерн-блот в поисках этого конкретного белка. Более того, исследователи могут захотеть определить, был ли белок каким-либо образом модифицирован - например, был ли он фосфорилирован (к нему была присоединена фосфатная группа), - и с помощью метода вестерн-блоттинга им нужны антитела, специфичные для модифицированного белка.
Тренировка
Может быть сложно правильно выполнить вестерн-блоттинг и получить хорошие результаты, поэтому персонал должен быть хорошо подготовлен.В этом, как и во многих других случаях, опыт, возможно, лучший наставник; однако даже для опытного специалиста Вестерн-блот отнимает много времени. Например, часть эксперимента по гель-электрофорезу обычно занимает от одного до двух часов. Конечно, другие задачи могут быть выполнены во время работы геля, но эксперимент все еще занимает некоторое время, чтобы получить результаты.
Другие ограничения
Антитела могут иногда демонстрировать некоторое нецелевое связывание, которое может привести к худшим результатам. Более того, с помощью вестерн-блоттинга вы используете антитело против определенного белка, поэтому ваши результаты сообщат вам только о наличии этого белка. Масс-спектрометрия высокого разрешения, напротив, выявляет все белки, присутствующие в образце, и в отличие от классического вестерн-блоттинга она количественная. Конечно, важно помнить, что масс-спектрометрия намного дороже, а также более технически сложна в использовании по сравнению с вестерн-блоттингом.