Содержание
ДНК
Дезоксирибонуклеиновая кислота и белки. ДНК организована в единицы, называемые генами, каждый из которых кодирует определенную последовательность РНК или белка. Гены изучаются, чтобы узнать о биологической структуре и функции, эволюции, болезни и многих других аспектах живых систем. Для детального изучения генов ДНК должна быть выделена и очищена от интересующих клеток.
Экстракция ДНК
Хотя ДНК из одной клетки может быть извлечена и изучена, ее недостаточно, чтобы увидеть невооруженным глазом. Чтобы получить количество, достаточное для спулинга, чем больше ячеек вам придется работать, тем лучше (много миллионов).
Точные протоколы значительно различаются для учета уникальных характеристик конкретных образцов, но основными этапами являются гомогенизация, лизис, расщепление, разделение и сбор. Процедуру лучше всего проводить в маленькой (в зависимости от размера образца) стеклянной или пластиковой пробирке.
Образец обычно смешивают или измельчают, чтобы тщательно отделить клетки друг от друга. Это делает клеточные ингредиенты более доступными для следующих реагентов. Затем в гомогенат добавляются детергент или ферменты для лизиса клеточных мембран (и ядерных мембран, если клетки эукариотические) для освобождения ДНК. В этот момент ДНК окружена белками, липидами, углеводами - всем остальным, что содержалось в клетках.
Дальнейшее ферментативное расщепление может быть необходимо для расщепления белков, чтобы они не связывались с ДНК и не влияли на ее сбор. ДНК отделяют от остального содержимого клеток путем добавления холодного, чистого этилового или изопропилового спирта. ДНК не растворяется в этих спиртах, поэтому она будет конденсироваться, пытаясь свести к минимуму свой контакт со спиртом. Конденсированные ДНК затем собирают, как правило, центрифугированием или спулингом.
Спулинг ДНК
Сбор ДНК с помощью спулинга эффективен, когда большое количество ДНК получается из процедуры экстракции. Это также отличный демонстрационный метод, поскольку внушительный клубок чистой ДНК хорошо виден.
Чтобы спулировать ДНК, стадия разделения должна проводиться осторожно. Если он не был частью ранее добавленной смеси реагентов для лизиса, концентрированный раствор соли (хлорид натрия) должен быть добавлен к раствору перед стадией добавления спирта. Холодный спирт медленно выливается в боковую часть пробирки, образуя слой поверх водного раствора, избегая перемешивания. Если все сделано правильно, спирт сформирует свой собственный слой поверх соленого слоя. Затем идет спулинг.
Чтобы собрать ДНК из соленого слоя, осторожно поместите стеклянную палочку для перемешивания через спиртовой слой, пока она не коснется дна пробирки. Медленно вращайте стержень между пальцами, наблюдая за интерфейсом между двумя слоями. Если присутствует достаточное количество ДНК, она слипается на границе раздела между слоями, образуя молочную полупрозрачную массу. Вращайте стержень, чтобы обернуть ДНК вокруг него (это катушечная часть) и вытащите его из трубки. ДНК можно перенести в другую пробирку с чистым спиртом для хранения или дальнейшего анализа.