Содержание
- Ферменты рестрикции и сайты рестрикции
- Правильная ориентация
- Для закрепления липких концов требуется меньше ДНК
- Различные ферменты могут дать один и тот же липкий конец
Молекулярное клонирование - это распространенный метод биотехнологии, с которым должен быть знаком каждый студент и исследователь. Молекулярное клонирование с использованием типа фермента, называемого рестриктазой, для разрезания человеческой ДНК на фрагменты, которые затем могут быть вставлены в плазмидную ДНК бактериальной клетки. Рестрикционные ферменты разрезали двухцепочечную ДНК пополам. В зависимости от фермента рестрикции разрез может привести к липкому концу или тупому концу. Липкие концы более полезны при молекулярном клонировании, потому что они гарантируют, что человеческий фрагмент ДНК будет вставлен в плазмиду в правильном направлении. Процесс лигирования или слияния фрагментов ДНК требует меньшего количества ДНК, когда ДНК имеет липкие концы. Наконец, множественные ферменты рестрикции липкого конца могут продуцировать один и тот же липкий конец, даже если каждый фермент распознает различную рестрикционную последовательность. Это увеличивает вероятность того, что ваша интересующая область ДНК может быть вырезана ферментами с липким концом.
Ферменты рестрикции и сайты рестрикции
Рестрикционные ферменты - это ферменты, которые разрезают узнающие специфические последовательности на двухцепочечной ДНК и разрезают ДНК пополам в этой последовательности. Распознанная последовательность называется сайтом рестрикции. Ферменты рестрикции называются эндонуклеазами, потому что они перерезают двухцепочечную ДНК, как обычно существует ДНК, в местах, которые находятся между концами ДНК. Существует более 90 различных ферментов рестрикции. Каждый распознает отдельный сайт рестрикции. Ферменты рестрикции расщепляют свои соответствующие сайты рестрикции в 5000 раз более эффективно, чем другие сайты, которые они не распознают.
Правильная ориентация
Рестрикционные ферменты бывают двух основных классов. Они или разрезают ДНК на липкие концы или тупые концы. Липкий конец имеет короткую область нуклеотидов, строительных блоков ДНК, которая является непарной. Этот непарный регион называется навесом. Говорят, что выступ является липким, потому что он хочет соединиться с другим липким концом, который имеет дополнительную последовательность выступов. Липкие концы похожи на давно потерянных близнецов, которые хотят крепко обнять друг друга, когда встретятся С другой стороны, тупые концы не являются липкими, потому что все нуклеотиды уже спарены между двумя цепями ДНК. Преимущество липких концов состоит в том, что фрагмент человеческой ДНК может помещаться в бактериальную плазмиду только в одном направлении. Напротив, если и человеческая ДНК, и бактериальная плазмида имеют тупые концы, человеческая ДНК может быть вставлена в плазмиду «голова к хвосту» или «хвост к голове».
Для закрепления липких концов требуется меньше ДНК
Хотя ДНК с липкими концами легче находить друг друга из-за их «липкости», ни липкие концы, ни тупые концы не могут слиться воедино в непрерывный кусок ДНК. Для образования непрерывного фрагмента ДНК, который полностью связан, требуется фермент, называемый лигазой. Лигазы связывают остов нуклеотидов с липкими или тупыми концами, образуя непрерывную цепочку нуклеотидов. Поскольку липкие концы быстрее находят друг друга из-за их притяжения друг к другу, процесс лигирования требует меньше человеческой ДНК и меньше плазмидной ДНК. Тупые концы ДНК и плазмиды реже обнаруживают друг друга, и, следовательно, для лигирования тупых концов требуется, чтобы в пробирку помещалось больше ДНК.
Различные ферменты могут дать один и тот же липкий конец
Сайты рестрикции расположены по всему геному организмов, но не расположены равномерно. В плазмидах они могут быть сконструированы так, чтобы располагаться непосредственно рядом друг с другом. Ученые, которые хотят вырезать фрагмент человеческой ДНК из человеческого генома, должны найти сайты рестрикции, которые находятся спереди и сзади от области фрагмента. В дополнение к тому, что фрагмент ДНК вставлен в правильном направлении, разные ферменты липкого конца могут создавать один и тот же липкий конец, даже если они распознают разные рестрикционные последовательности. Например, BamHI, BglII и Sau3A имеют разные последовательности распознавания, но дают один и тот же липкий конец GATC. Это увеличивает вероятность того, что будут сайты ограничения липкого конца, которые окружают интересующий вас человеческий ген.