Согласно веб-сайту BioWeb Университета Висконсина, праймер для ПЦР представляет собой короткий синтетический олигонуклеотид (обычно длиной от 18 до 25 оснований), используемый для амплификации определенных областей ДНК в методике молекулярной биологии, известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Требуются как прямой, так и обратный праймеры, сконструированные так, чтобы они были обратными комплементами цепи ДНК, чтобы фланкировать и связываться с желаемой областью ДНК. Когда ученые хотят провести исследование конкретного гена или области ДНК, им сначала необходимо выполнить ПЦР, чтобы получить достаточное количество целевого региона для работы. Разработка последовательностей праймеров для интересующей области может быть необходимой, если они еще не доступны в ранее опубликованных исследованиях или коммерческими средствами.
Получите нуклеотидную последовательность интересующего гена или области ДНК и решите, как долго фрагмент вы хотите амплифицировать. Прямой и обратный праймеры предназначены для связывания в начале и в конце нужного фрагмента. Как правило, традиционные методы ПЦР используют праймеры, которые окружают область длиной от 100 до 1000 пар оснований, в то время как методы ПЦР в реальном времени используют фрагменты длиной от 50 до 200 пар оснований.
Решите, где в последовательности вы хотите, чтобы праймеры лежали. Например, вам может понадобиться расположение рядом с 5 или 3 концом последовательности или в середине. При желании укажите местоположение праймеров для охвата интрона.
Следуйте рекомендациям по дизайну грунтовки. Успешная амплификация продукта ДНК зависит от качества праймеров, и определенные переменные имеют решающее значение.
Дизайн грунтовки должны быть длиной от 18 до 24 оснований. Винсент Р. Прециозо, доктор философии из Brinkmann Instruments Inc., предполагает, что эта длина достаточно велика, чтобы быть чрезвычайно специфичной для желаемой области ДНК, но достаточно коротка, чтобы легко связываться (отжигать). Температура плавления грунтовки (Tm) должна составлять от 55 до 80 градусов Цельсия, достаточно низкая, чтобы обеспечить полное плавление при температуре 90 градусов Цельсия или выше, но достаточно высокая, чтобы обеспечить отжиг. Содержание GC (процентное содержание Gs и Cs в последовательности) должно составлять от 40 до 60 процентов. 3-й конец последовательности праймера должен заканчиваться C или G (называемый GC-зажимом), чтобы способствовать связыванию, поскольку нуклеотиды G и C имеют более прочные связи, однако избегайте наличия трех или более G или C в последних пяти основаниях. последовательности.
Избегайте прогонов четырех или более из одного основания (например, ACCCC ...) или четырех или более динуклеотидных повторов (например, ATATATAT ...), потому что они могут вызвать неправильную заправку.Разработка праймеров без гомологии между праймерами (более трех оснований, которые дополняют внутри одного праймера) или гомологии между праймерами (где прямой и обратный праймеры имеют дополняющие последовательности). Это может вызвать самостоятельные димеры или праймеры-димеры, где праймеры связываются с собой вместо связывания с желаемой последовательностью ДНК.
Используйте онлайн-ресурсы и веб-сайты, которые помогают в разработке праймеров или помогают проверять последовательности праймеров на самодостаточность или потенциал для создания вторичных структур, таких как шпильки. Некоторые веб-сайты дизайна праймеров включают Массачусетский технологический институт Primer3, Национальный центр биотехнологической информации Primer-Blast и Интегрированные ДНК-технологии OligoAnalyzer.