Содержание
Генетический синий цвет клетки закодирован в ее генетическом материале или ДНК. Поскольку ДНК никогда не покидает ядро клетки, для того чтобы эта информация попала в цитоплазму, где находятся другие белки и биохимические компоненты, необходимо сначала транскрибировать ДНК в мессенджер РНК (мРНК или поли (А) РНК). Затем эта мРНК превращается в белки, которые выполняют многие функции клетки. Для обнаружения или количественного определения очень редких мРНК, создания зондов для микрочипов или создания библиотек молекул комплементарной ДНК мРНК должна быть выделена. Однако выделение общей РНК (то есть всей РНК в клетке) и последующее выделение мРНК не являются взаимоисключающими процессами; первое должно быть выполнено для того, чтобы мРНК была извлечена.
Выделение мРНК из тотальной РНК
Гомогенизация тризола: Тотальная РНК включает все мРНК, трансферную РНК, рибосомальную РНК и другие некодирующие РНК. Чтобы отделить их от других клеточных компонентов, клетка сначала раскрывается, чтобы высвободить свое содержимое. Это делается путем ресуспендирования клеток, осажденных центрифугированием (вращением на высоких скоростях) в реагенте TRIzol (Life Technologies). Другие версии TRIzol (такие как TRI Reagent Ambion) работают аналогично.
Полная изоляция РНК: серия центрифугирований используется для разделения различных компонентов (белков, ДНК, РНК) клетки на слои или фазы в суспензии. Верхняя желтая фаза состоит из жира и может быть отброшена. Желаемая фаза окрашена в красный цвет, содержит общую РНК и сохраняется. После проведения экстракции фенол-хлороформом и серии промывок спиртом с использованием изопропанола и этанола РНК может быть гранулирована для выделения мРНК. Добавьте ингибиторы РНКазы, чтобы этот фермент не разрушал всю РНК.
Экстракция мРНК. Обычно используют набор для выделения мРНК, поскольку домашние лабораторные протоколы не генерируют большие количества высокоочищенных мРНК. Коммерческие наборы включают в себя набор Invitrogen FastTrack 2.0 или комплект Ambion Poly (A) Pure mRNA. Эти основные шаги являются общими для таких комплектов:
a) Смешайте буфер для лизиса, ингибируемый РНКазой, который входит в набор, до 300 микролитров суммарной РНК.
б) Нагреть в течение 5 минут при температуре 65 градусов Цельсия, а затем сразу же охладить образец на льду в течение одной минуты.
c) Смешайте его с 0,5 М хлорида натрия и затем полностью растворите олиго-дТ (олигодезокситимидиловую кислоту) в этом образце.
d) Центрифугируйте этот образец и извлеките супернатант, который несколько раз промывают в серии связывающих буферов и буферов с низким содержанием соли, представленных в наборах.
e) элюировать мРНК несколько раз, пока не будет получен указанный объем набора (например, 500 микролитров).
е) Осадок элюата осаждением из ацетата натрия и этанола. Повторное приостановить в до 20 микролитров воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (DEPC).
g) Хранить при температуре -80 градусов по Цельсию и проверить качество и количество с помощью спектрофотометрии.